Bondades de la autofluorescencia

Mónica Ramírez-Vázquez, Jean-Christophe Breitler, Olinda E. Velázquez-López y Eliel Ruíz-May

La microscopía óptica avanzada (epifluorescencia, confocal) se basa en el uso de la fluorescencia, esta técnica no invasiva es útil para obtener imágenes de alta resolución y reconstrucciones tridimensionales. Es una herramienta muy útil ya que facilita la exploración de los patrones de distribución de las células, colonias u organismos dentro de una comunidad, aporta información sobre la respuesta fisiológica de los organismos a un determinado ambiente y también ayuda para reconocer los pigmentos naturales (clorofilas, ficobilinas, etc.).

Palabras clave: autofluorescencia, microscopía óptica avanzada, pigmentos vegetales

Dentro de la botánica existen diversos grupos como las cianobacterias, algas y las plantas que son seres vivos muy complejos; cuentan con una fábrica (cloroplasto ó lamelas tilacodales) que les permite producir su propio alimento mediante la fotosíntesis. El cloroplasto es un orgánulo organizado por una doble membrana que guarda en su interior finas fibras llamadas tilacoides que se apilan y forman granas, donde se localizan los pigmentos fotosintéticos (clorofilas y pigmentos accesorios). Para el caso de cianobacterias que son organismos procariontes no existe un cloroplasto, sin embargo, tienen tilacoides dispersos en el citoplasma donde se almacenan tanto la clorofila a como otros pigmentos (ficobilinas). 

La mayoría de las cianobacterias, algas y plantas generalmente son de un color azul-verdoso o verde intenso debido a la presencia de la clorofila a, pero hay casos donde este color puede ser enmascarado por la presencia de otros pigmentos (otras clorofilas, ficobilinas, carotenos, entre otros). Todos estos pigmentos tienen la capacidad de emitir luz cuando son expuestos a radiación, esta condición se define como autofluorescencia.

Para observar la autofluorescencia, las técnicas de microscopia de fluorescencia y/o confocal son herramientas que desde su inicio en los años 50's revolucionaron la forma de estudiar a los sistemas biológicos, y el reino vegetal no fue la excepción. Estas técnicas de microscopía se basan empleando el uso de la fluorescencia para diversos estudios que son poco frecuentes en otras formas de obtención de imágenes; son rápidas, sencillas y no destructivas. Pueden ser muchas las aplicaciones del uso de la microscopía de fluorescencia y/o confocal en estudios del reino vegetal, a continuación, algunos ejemplos.  

La piel de los frutos (cutícula)

La cutícula es la capa externa de un fruto, cuya función es similar a la piel, protege y aísla del exterior al fruto (evita la pérdida de humedad, además de servir como barrera contra patógenos). La microscopía óptica avanzada tiene un papel fundamental, ya que por medio de diferentes técnicas permite detectar posibles afectaciones o enfermedades ^[1]. El estudio de la cutícula genera conocimiento para el tratamiento que se le dará al fruto una vez que ha sido cosechado. 

Para este caso, el empleo de un microscopio de fluorescencia se usa en la visualización directa de tejidos cercanos a la corteza mediante la tinción del tejido, por otro lado, también se puede detectar alteraciones celulares y/o aumento de grasas (lípidos) resaltados con colorantes específicos y posteriormente realizar un análisis de imagen acorde a los resultados. A continuación, se muestra el corte histológico de la cutícula de un aguacate donde destaca la autofluorescencia de los cloroplastos y el marcaje específico para la detectar lípidos (Fig.1).

Localización de hongos fitopatógenos

Muchos hongos han sido clasificados como uno de los principales causantes de enfermedades en especies vegetales ^[2]; poco más de 8, 000 especies de hongos pueden ocasionar daños, provocando pérdidas de especies biológicas y agroalimentarias de impacto económico ^[3]. A este tipo de hongos se les conoce como fitopatógenos; los cuales emplean distintas estrategias de vida para proliferar, colonizar y como consecuencia causar enfermedad. 

Los hongos considerados fitopatógenos pueden provocar graves daños debido a sus diversos metabolitos, los cuales tienen la capacidad de secretar enzimas y fitotoxinas que aumentan su virulencia resultando altamente tóxicas y en algunas ocasiones son letales para su huésped ^[3,4]. La vía de acceso de estos patógenos a su huesped se da por varias rutas ya sea por la raíz o a través de los estomas de las hojas. Con la microscopía confocal se puede observar el proceso de la infección (entrada del hongo por los estomas) para esto se usa un colorante (marcador) para resaltar la pared del hongo y la autofluorescencia de los cloroplastos de las hojas (Fig.2).

Productividad de cultivos

Existen diversas causas ambientales que pueden afectar a muchos cultivos de importancia comercial como el café, tomate, calabaza, frijol, cebolla, entre otros. La luz, humedad y temperaturas extremas son algunos tipos de estrés abióticos que pueden causar efectos adversos en el crecimiento y productividad en estos cultivos. Debido a que las plantas requieren de energía solar (luz) para llevar a cabo la fotosíntesis, cuando esta no es de buena calidad o es excesiva para la planta, estás lo manifiestan modificando la cantidad de los diferentes pigmentos durante las diferentes etapas de su desarrollo ^[5].

Con la microscopía confocal es posible estimar la eficiencia de cultivos, al obtener datos cualitativos sobre la cantidad de los pigmentos (clorofila a) y posibles alteraciones en el aspecto y estructura de la planta ocasionado por la baja o alta exposición solar (Fig.3).

Los colores de las cianobacterias

Las cianobacterias son los primeros seres vivos que habitaron nuestro planeta. Son organismos procariontes fotosintéticos que carecen de cloroplastos; sin embargo, esto no es una limitante para que puedan producir su propio alimento. Estos organismos tienen finas fibras (tilacoidales) dispersas en el citoplasma donde se localizan sus pigmentos (clorofila a y ficobiliproteínas). 

Con la microscopía confocal espectral es posible determinar y cuantificar la presencia de distintos pigmentos como clorofilas (a, b) y otros pigmentos accesorios (xantofilas, ficobilinas, etc.). Esta técnica suministra información sobre la identidad de varios pigmentos. La medición de la autofluorescencia de la clorofila puede ser un mecanismo de valoración para estimar la tolerancia del ambiente donde habiten. Al usar un marcaje específico es fácil ubicar la presencia de sustancias poliméricas extracelulares que pueden secretar ^[6,7]. (Fig.4).

Conclusión

La utilización de estas herramientas en Biología Celular permite, gracias a su facilidad de uso, diseñar experimentos destinados a ampliar el conocimiento de la fisiología de los organismos fotosintéticos, analizando la autofluorescencia específica emitida por su aparato fotosintético en distintas condiciones ambientales. Se puede detectar alteraciones celulares, observar el proceso y el nivel de una infección de patógenos, e incluso evaluar los niveles de estrés abióticos en relación con la productividad.

Referencias 

• Tafolla-Arellano J., Zheng Y., Sun H., Jiao Ch., Ruiz-May E., Hernández-Oñate M.A., González-León A., Báez-Sañudo R., Fei Z., Domozych D., Rose J.K.C & Tiznado-Hernández M.E. (2017). Transcriptome Analysis of Mango (Mangifera indica L.) Fruit Epidermal Peel to Identify Putative Cuticle-Associated Genes. Sci Rep 7, 46163 doi:10.1038/srep46163

• Marin-Felix, Y., Groenewald, J. Z., Cai, L., Chen, Q., Marincowitz, S., Barnes, I. & De Beer, Z. W. (2017). Genera of phytopathogenic fungi: GOPHY 1. Studies in mycology, 86, 99-216.

• Guzmán, M.D.P.R. (2001). Biodiversidad de los hongos fitopatógenos del suelo de México. Acta Zoológica Mexicana (nueva serie), (Es1), 53-78.

• Villa-Martínez, A., Pérez-Leal, R., Morales-Morales, H. A., Basurto-Sotelo, M., Soto-Parra, J. M., & Martínez-Escudero, E. (2015). Current situation of Fusarium spp in the control and evaluation of the antifungal activity on vegetables extracts. Acta Agronómica, 64(2), 194-205.
• Taiz L. & Zeiger. (2010). Plant physiology. Sinauer Associates, Inc., Publishers. Sunderland, Massachusetts. 782 pp. ISBN-10: 0878938664.

• Roldán M., Thomas F., Castel S., Quesada A. & Hernández-Mariné M. (2004). Noninvasive pigment identification in single cells from living phototrophic biofilms by confocal imaging spectrofluorometry. Appl Environ Microbiol 70:3745-3750.

• Ramírez M., Hernández-Mariné M., Novelo E. & Roldán M. (2010). Cyanobacteria-containing biofilms from a Mayan monument in Palenque, Mexico. Biofouling 26:399-409.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Alhelí González y Daniel F. García por su valiosa ayuda en el procesamiento de imágenes. Al Dr. Alfonso Méndez por el uso de imagen (Fig.2). Y finalmente al Proyecto FORDECyT “Generación de estrategias científico-tecnológicas con un enfoque multidisciplinario e interinstitucional para afrontar la amenaza que representan los complejos ambrosiales en los sectores agrícola y forestal de México” y a su responsable técnico Dra. Diana Sánchez-Rangel (Cátedra CONACyT).

Pie de figuras

Fig.1. Sección transversal de la cutícula de un aguacate (Persea americana). En rojo brillante la autofluorescencia de los cloroplastos (C); rojo medio (tinción de lípidos (L) y en verde epidermis (E).

Fig.2. Envés de una hoja de aguacate (Persea americana). Hifas invadiendo los estomas (Es) para llegar al interior del tejido. El color rojo es la autofluorescencia de los cloroplastos (C); en azul las hifas del hongo (H).

Fig.3. Corte transversal de una hoja de café (Coffea arabica). El color rojo indica la autofluorescencia de los cloroplastos (C); en cian el parénquima (P).

Fig.4. Filamentos de cianobacteria. El color rojo indica la clorofila a (Ca) en las céiulas del tricoma; en azul las ficobiliproteínas (Fb); el rosa indica la presencia de clorofila a y ficobiliproteínas en la misma concentración. El verde resalta la presencia de la vaina del filamento, se hace uso de un marcaje para azúcares (V).